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生物素标记试剂的合成方法改进及其在DNA合成中的应用

             生物素标记试剂的合成方法改进及其在DNA合成中的应用
                                   杨明蓉1,2,唐卓2,陈应春1
    (1.四川大学华西药学院,四川成都610041;2.中国科学院成都生物研究所,四川成都610041)
    摘要:以生物素,4,4’-二甲氧基三苯基氯甲烷,6-氨基-1-己醇,2-氰基乙氧基-双(N,N-二异丙基)亚磷酰胺等为原料,采用改进方法合成了生物素标记试剂———[1-N-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-生物素-6-氨基己基]-2-氰乙氧基-N,N-二异丙基亚磷酰胺(3),总收率51.0%,其结构经1H NMR,13 C NMR,31 P NMR和MS确证。通过固相亚磷酰胺三酯法,应用3合成了一段含有十个碱基的5’-端生物素标记的寡核苷酸链,其结构经MS确证。
    关键词:生物素;标记;固相亚磷酰胺三酯法;DNA合成
    中图分类号:O626;O627.51文献标识码:A文章编号:1005-1511(2012)03-0331-03
    近年来,核酸探针杂交技术在医疗科研和临床中被广泛采用,成为一项直接检查病原体、癌基因、遗传病基因突变等的重要手段。用于杂交的核酸探针必须先进行标记,可分为同位素标记和非同位素标记两大类。生物素标记的核酸探针属于非同位素标记,它是利用亲和素对生物素有极高亲和力的原理,分子杂交后用亲和素或链霉亲和素进行检测[1~4]。生物素标记探针稳定,不失活,并能配用多种检测系统,简单方便。
    Richard T Pon[5]设计合成了一种较为理想的生物素标记试剂———[1-N-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-生物素-6-氨基己基]-2-氰乙氧基-N,N-二异丙基亚磷酰胺(3)。3所含的6-氨基己基侧链显著增加了生物敏感性[6],同时3中的二甲氧三苯基增加了稳定性,不仅有利于寡核苷酸链的合成与纯化,而且还可以在DNA合成仪上通过颜色变化检测连接效率。
    为了推进3的应用,本文改进文献[5]方法,先将生物素与DMTrCl(4,4’-二甲氧基三苯基氯甲烷)反应制得1-N-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)生物素(1);1与6-氨基-1-己醇在氯甲酸乙酯中缩合制得1-N-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)生物素-6-氨基己醇(2);2与磷试剂2-氰乙氧基-双(N,N-二异丙基)亚磷酰胺(Ⅰ)[7]反应合成了3(Scheme1),总收率51.0%,其结构经1H NMR,13 C NMR,31P NMR和MS确证。

    改进方法将文献[5]路线由5步简化为3步,提高了生物素的转化率,同时避免了昂贵的硅试剂及TBAF(四丁基氟化铵)的使用。
    为了验证改进方法的可行性,本文还采用固相亚磷胺三酯法,应用3合成了一段含有十个碱基的5’-端Biotin标记的寡核苷酸链Biotin-A-A-A-A-A-A-A-A-A-A(记为Biotin-A10)[8~11],其结构经MS确证。
    1·实验部分
    1.1仪器与试剂
    Yanaco型显微熔点仪(温度计未校正);Brucker-600 MHz型核磁共振仪(CDCl3为溶剂,TMS为内标);Alltech HPLC 1500型液相色谱仪(HPLC);Bruker Daltonics ESI-Bio TOF-Q型高分辨质谱仪;ABI 394型DNA合成仪。
    硅胶300目~400目,其余所用试剂均为分析纯;反应均在无水条件下进行,所用试剂都需作无水处理。
    1.2合成
    (1)1的合成在反应瓶中依次加入生物素2 g(8.2 mmol)的吡啶(40 mL)溶液,DMTrCl 8.32 g(24.6mmol),Et3N 828 mg(8.2 mmol)和DMAP(4-二甲氨基吡啶)250.4 mg(2.08 mmol),搅拌下于70℃反应4 h。浓缩后用氯仿稀释,分液,有机相用5%柠檬酸钠溶液洗涤三次,无水硫酸钠干燥,浓缩后经硅胶柱层析[洗脱剂:V(甲醇)∶V(二氯甲烷)=3∶97]纯化得橙红色固体1 3.36 g,收率75.0%;1H NMR(DMSO-d6)δ:1.43~1.64(m,6H,CH2),2.16~2.19(m,4H,SCH2,COCH2),3.11(m,1H,SCH),3.72(s,6H,OCH3),4.27~4.33(m,2H,NCH),6.70(s,1H,NH),6.84(d,4H,ArH),7.22(m,9H,ArH),11.94(s,1H,CO2H)。
    (2)2的合成
    在圆底烧瓶中加入1 1.65 g(3.02 mmol)的THF(16 mL)溶液和Et3N 306 mg(3.02 mmol),搅拌下于0℃缓慢滴加氯甲酸乙酯654 mg(6.04mmol),滴毕,反应1 h;冷却至-20℃,加入6-氨基-1-己醇608 mg(6.04 mmol),反应过夜。加水稀释后用氯仿(3×100 mL)萃取,合并萃取液,用无水硫酸钠干燥,浓缩后经硅胶柱层析[洗脱剂:V(甲醇)∶V(二氯甲烷)=1∶20]纯化得白色固体2 1.56 g,收率79.3%;1H NMRδ:1.24~1.70(m,14H,CH2),2.15(t,2H,NCH2),2.25~2.60(m,2H,COCH2),3.08~3.23(m,3H,CHS),3.60(t,2H,OCH2),3.80(s,6H,OCH3),4.36(m,2H,NCH),5.10(s,1H,NH),5.63(s,1H,NH),6.81(d,4H,ArH),7.22(m,9H,ArH)。
    (3)3的合成
    在反应瓶中依次加入2 645 mg(1 mmol)的无水乙腈(10 mL)溶液,四氮唑140 mg(2 mmol),DIPA(N,N-二异丙胺)242.3 mg(2.4 mmol)和Ⅰ600 mg(2 mmol),搅拌下于室温反应2 h。用二氯甲烷(200 mL)稀释,分液,有机相依次用5%碳酸氢钠溶液和饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,浓缩后经硅胶柱层析[洗脱剂:V(Et3N)∶V(氯仿)=1∶19]纯化得白色固体3 724 mg,收率85.7%,m.p.148℃~150℃;1H NMRδ:1.21(m,12H,CH3),1.24~1.90(m,14H,CH2),2.17(t,2H,NCH2),2.22~2.60(m,2H,COCH2),2.65(t,2H,CH2CN),3.08~3.30(m,3H,CHS),3.53~3.78(m,4H,OCH2),3.80(s,6H,OCH3),4.35(m,2H,CHN),5.13(s,1H,NH),5.61(s,1H,NH),6.81(d,4H,ArH),7.22(m,9H,ArH);13C NMRδ:11.44,24.55,24.60,24.66,25.23,25.61,26.63,29.50,39.31,42.96,43.01,46.20,54.41,55.23,58.20,59.66,65.40,72.74,112.79,117.77,126.86,127.48,129.74,131.30,135.83,135.91,143.86,158.39,161.81,172.92;31P NMRδ:147.81(s);ESI-MS m/z:868{[M+Na]+}。
    1.3 3在合成DNA中的应用
    在反应瓶中加入0.1 mol·L-13的乙腈溶液,置DNA合成仪上,在一段含10个A碱基的寡核苷酸链(A10)的5’-端连接3;其N-DMT(N-上的4,4’-二甲基三苯基甲基保护基)经5%三氯乙酸/二氯甲烷脱去后于55℃氨解10 h。经反相HPLC纯化(条件见表1)得目标序列Biotin-A10;ESI-MS m/z:3 474。
             
    2·结果与讨论
    本文以文献[5]工作为基础,改进合成3的方法。由1合成2采用混合酸酐法,利用氨基与羟基反应活性的差异一步生成酰胺,避免了羟基的保护与脱保护,简化了反应步骤。
    由2合成3选用Ⅰ为磷试剂比2-氰基乙氧基-N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺(Ⅱ)[5]的稳定性更好、后处理方便、且原料转化率高,3总收率达51.0%。此外,Ⅰ可大量合成,相对于昂贵的Ⅱ成本大大降低,有利于工业化生产。
    本文将3应用于合成DNA,成功地制得Bio-tin-A10,充分显示了3在合成DNA中的广阔应用前景。
    为了提高生物素的转化率,DMTrCl,6-氨基-1-己醇,Ⅰ均要过量;因为Ⅰ易被氧化,由2合成3应在氮气保护下进行。
    参考文献:略


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